结核分支杆菌(TB)核酸检测标准操作规程

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结核分支杆菌（TB）核酸检测标准操作规程

1.目的：规范结核分支杆菌（TB）核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。

2.应用范围：PCR实验室。

3.职责：

3.1 文件编写：PCR 实验室技术员。

3.2 文件审核：PCR 实验室负责人。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR 实验室所有工作人员。

4. 参考文献：

4.1《中山大学达安基因股份有限公司结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书》

4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》

5. 内容：

5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。

5.2 实验原理：

用一对结核分支杆菌(TB)特异性引物和一条结核分支杆菌(TB)特异性荧光探针，配以PCR反应液、

耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、

低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而检测结核分支杆菌核酸。主要

用于TB感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。

5.3 性能参数：

5.3.1 检测下限：5.0×102基因拷贝/ml。

5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。

5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1 标本类型：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液等。

5.4.1.1 痰液：清晨从肺深部咳出痰液，取1～3 ml置于无菌玻璃管内，密封送检；婴幼儿用密闭容器

与无菌吸痰器相连，吸取痰液，密封送检。

5.4.1.2 肺及支气管灌洗液：收集灌洗液1～3 ml置于无菌玻璃管内，密封送检；

5.4.1.3 尿液：用无菌5ml玻璃管收集中段尿1～3ml，密封送检。

5.4.2 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。

5.4.3 运送条件：标本运送采用冰壶。

5.5 设备和试剂：

5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混

匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。

5.5.2 试剂：

5.5.2.1 试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司结结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂

盒》

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3400392号

5.5.2.3 试剂组成：DNA 提取液（500μL/管）2 管；TB-PCR 反应管（未贴标签管）20 人份；TB 临

界阳性质控品（50μL/管）1 管；TB 强阳性质控品（50μL/管）1 管；阴性质控品（250μL/管）1 管。

5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。

5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。

5.6 操作过程：

5.6.1 标本与质控品的处理：

5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100℃。

5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。

5.6.1.3 痰液标本的处理：

5.6.1.3.1 于痰液中加入4倍体积的4% NaOH，摇匀，室温放置30分钟待液化；

5.6.1.3.2 用枪头或吸管混匀后吸取1ml液体至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min；

5.6.1.3.3 去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；

5.6.1.3.4 去上清，向沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,000

rpm离心5min，备用。

5.6.1.4 肺及支气管灌洗液、尿液的处理：

5.6.1.4.1 取灌洗液或尿液1.0ml至1.5ml离心管，12,000rpm离心5min；

5.6.1.4.2 去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；

5.6.1.4.3 去上清，向沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,000

rpm离心5min，备用。

5.6.2 排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。

5.6.3 加样：从-20℃冰箱取出TB-PCR 反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接

加入处理好的样本DNA和阴性质控、阳性质控品各5μL，2,500rpm 离心1 min。

5.6.4 DA7600荧光定量扩增仪的设置及结果分析：参见《达安7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养

规程》及《基因扩增检测及结果分析规程》。

5.6.5 记录实验数据。

5.6.6 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩

增管破裂而导致污染。

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摘要：

《结核分支杆菌（TB）核酸检测标准操作规程》摘要1目的与应用：规范结核分支杆菌（TB）核酸检测操作确保结果准确适用于PCR实验室。2职责：技术员编写文件实验室负责人审核实验室主任审批PCR实验室全员执行。3检测内容：方法：PCR荧光探针法。原理：利用特异性引物、探针等通过PCR体外扩增DNA并实时监测用于TB感染辅助诊断及疗效监测。性能参数：检测下限为5010基因拷贝ml线性范围50105010基因拷贝ml。标本采集：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液等需密封送检并妥善保存运送。4设备试剂：DA7600荧光定量PCR仪等设备；达安基因公司试剂保存于20有效期6个月。5操作过程：包括标本与质控品处理、排版、加样、仪器设置及结果分析、记录数据、处理产物、关闭电源等步骤。6参考值及意义：痰液2510基因拷贝ml灌洗液尿液5010基因拷贝ml可反映TB存在及复制活跃度。7安全防护：涵盖试剂处理、仪器使用、生物安全等方面注意事项。

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