病毒和病毒成份的提纯

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第十四章 病毒和病毒成份的提纯
一、病毒的提纯
()沉淀法
()层析法
()两相溶剂间分配系数法
()红细胞吸附法
()电泳法
()超速离心法
()超滤法
二、病毒蛋白亚单位的分离
三、病毒脂质的抽提
四、病毒糖类的抽提
一、病毒的提纯
所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法,以不使病毒受损伤和失活为前提,
去除宿主细胞组分等非病毒杂质,提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研
究的重要前提,病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分与
其遗传物质——DNA 或 RNA 的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念,很难有绝对的标准,通常以下几点可以作为判定标
准。
1.物理均一性
测定病毒样品的物理均一性,是证明其纯度的常用方法,包括电镜检查、病毒粒子沉
降系数和扩散常数与其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
2.病毒滴度与蛋白含量的比例
测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例,也是一种通常采
用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。
3.免疫学反应
免疫反应单一而无非特异反应,则说明病毒材料比较纯净。
4.结晶形成
病毒粒子在十分纯净的情况下,经常可以形成结晶,但少数混有杂质的病毒样品亦
可形成结晶,所以这也只是一个相对标准。
病毒提纯的主要依据和条件有:
(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增, 要在病毒不失活的前提下,使之从细
胞中释放出来,去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病
毒粒子被释放到细胞外,可以从培养液或尿囊液中提纯; 而另一些病毒如腺病毒、乳多
空病毒、小 DNA 病毒,在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外,大量提纯时必须首先
裂解细胞,使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲
击、中性去污剂裂解、 蛋白酶解等物理和化学的方法。 通过这些方法处理获得的粗
的病毒悬液,其中常含有大量的细胞碎片,一个有效的方法是以 2000~ 6000r/min
30~40 ,可除去 90%的细胞碎片和杂质。
(2)病毒粒子实际上是大的蛋白粒,可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。
(3)对大小、形度高度一的病毒粒子,可以采用分分离的技术当然
的病毒,其生特性与理化学性质不因此提纯方法也不
(一)沉淀法
主要是从的悬液中浓缩病毒,有中性、聚乙二(PEG)沉、有
剂沉法、等电点沉法、皂土法和鱼精蛋白沉法等。
1.中性盐沉淀法
病毒45%和度中沉 性。
的组培养液中加入体积酸铵,可以很容易病毒毒、
新城疫病毒等。
2.聚乙二醇沉淀法
乙二醇(PEG)为水溶性非离子物,有各种不的分子量, 用病毒沉的
主要是分子量为 2000~6000 PEG将 PEG 配50%左右液,或直接将固体 PEG 加于
, 使 到所需浓度,通常在 4℃ 搅 拌 后 离 使病毒沉
Tanncock(1985 年)成功地PEG 浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3.有机溶剂沉淀法
甲醇氯仿、正丁醇氟碳物等都可用提纯病毒,但乙醚氯仿脂溶剂对
于具质囊膜的病毒破坏活作用,适于病毒的浓缩提纯。
4.等电点沉淀法
病毒粒子在等电点时,的正中和失去排斥
作用而生沉多数病毒的等电点在 pH4.5~5.5 因此pH3~6X 围内均可沉
由于分细胞成份在等电点时但从感染的组培养
液中浓缩病毒,可以获得较。应用X 围的等电点沉病毒时,必
注意 pH 对病毒活性的影响与病毒粒子电与组蛋白电异。
5.皂土法
Girin(1989 年)应用皂土性条件下(pH4~4.5)吸附轮状SA-11,
条件下〔pH 8.5〕使其洗脱下来,从而到纯化的。
6.鱼精蛋白沉淀法
鱼精蛋白为性蛋白,蛋白质的作用,于 50nm
病毒共同而不影响病毒的感染力。当向种沉加入 1mol/L NaCl 时,病毒
释放到悬液中,而鱼精蛋白仍然直径 50nm 的小病毒则不与蛋白共同
因此,可鱼精蛋白去除病毒材料中直径于 50nm 的异种蛋白质。
(二)层析法
病毒粒子表面携带特定的电荷群因此病毒对离子交换树脂类似的其它吸附
和性分为,一种是据病毒粒
的电荷进异性度的离子毒粒子解另一种是
负吸宿主细胞成份等非病毒蛋白,而毒粒子通过。收集
后经速离回收病毒由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不因此
吸附剂的和性也有显著异。
1.萄聚糖柱层析法
将初步浓缩的材料,通过糖 G-150 G-200 柱层0.02~0.15mol/L
磷酸(pH7.6)定 280nm OD含病
相 混 浓缩,透 析 之后,可得到比较纯净的病毒,Nagano(1989 ) 用
摘要:

第十四章摘要:病毒和病毒成份的提纯病毒提纯是病毒学研究的重要前提旨在去除宿主细胞组分等非病毒杂质获取高纯度、浓缩的病毒样品。提纯的纯度标准包括物理均一性、病毒滴度与蛋白含量的比例、免疫学反应和结晶形成。提纯的主要依据和条件包括病毒在活细胞内寄生、复制和增殖的特性以及病毒粒子作为大蛋白颗粒的特性。提纯方法包括:1沉淀法:如中性盐、聚乙二醇、有机溶剂、等电点、皂土和鱼精蛋白沉淀法。2层析法:利用病毒粒子表面电荷进行正吸附或负吸附包括萄聚糖柱、凝胶、离子交换纤维素柱和亲和层析法。3两相溶剂间分配系数法:利用高分子物质在两相溶剂中的分配系数不同进行纯化。4红细胞吸附法:通过病毒与红细胞表面粘蛋白的吸附现象进行提纯。5电泳法:根据病毒粒子携带的电荷在电场中的移动进行提纯。6超速离心法:包括差速离心、速度区带离心和平衡密度梯度离心法用于分离不同大小的病毒粒子。7超滤法:利用超滤膜浓缩病毒样品具有操作简便、对产物损害小的优点。此外还包括病毒蛋白亚单位的分离、病毒脂质的抽提和病毒糖类的提取以研究病毒的化学成分和遗传物质。

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