移植不同剂量脐带间充质干细胞提高老年痴呆大鼠学习记忆能力的比较汇编
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周俊，男，1983 年生，
湖南省永州市人，汉族
2010 年湖南中医药大学
毕业，硕士，主治医师
主要从事脑病相关研究。
通讯作者：周德生，博
士，主任医师，教授，
湖南中医药大学第一附
属医院脑病科，湖南省
长沙市 410007
中图分类号:R394.2
文献标识码:B
文章编号:2095-4344
(2016)50-07524-06
稿件接受：2016-10-16
移植不同剂量脐带间充质干细胞提高老年痴呆大鼠
学习记忆能力的比较
周 俊1，周德生2(1海南省安宁医院，海南省海口市 570100；2湖南中医药大学第一附属医院脑病科，湖南省长沙市 410007)
引用本文：
周俊，周德生
.
移植不同剂量脐带间充质干细胞提高老年痴呆大鼠学习记忆能力的比较
[J].
中国组织工程研究，
2016
，
20(50):7524-7529.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.011 ORCID: 0000-0001-6036-5149(周德生)
文章快速阅读：
文题释义：
海马体：又名海马回、海马区、大脑海马，海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储
存在海马体中，如果一个记忆片段，比如一个电话号码或者一个人在短时间内被重复提及的话海马体
就会将其转存入大脑皮质，成为永久记忆。
老年性痴呆模型建立方法：①与中枢胆碱能神经系统有关的痴呆动物模型：兴奋性毒素损伤 Meynert
基底核(NBM)所致的痴呆动物模型、选择性损伤基底前脑胆碱能神经元的痴呆动物模型、电解损伤基
底核的痴呆动物模型；②与 β-淀粉样蛋白有关的痴呆动物模型：β-淀粉样蛋白灌注模型、β-淀粉样蛋
白的神经毒性作用、转基因动物模型；③铝过量造成的阿尔茨海默病动物模型；④自然衰老的动物模
型；⑤实验性自动免疫痴呆模型。
摘要
背景：移植有活力、分化能力强的干细胞修复神经组织来延缓老年痴呆症的发病进程是研究人员的重
要目标。
目的：探讨不同剂量脐带间充质干细胞移植对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响。
方法：选取 50 只7月龄 SD 大鼠随机分为正常组、模型组以及高、中、低剂量脐带间充质干细胞移植
组，每组 10 只。模型组和移植组腹腔注射 D-半乳糖 150 mg/kg 建立老年痴呆模型，正常组腹腔注射
生理盐水，连续 90 d。收集第 3代脐带间充质干细胞，以低、中、高 3个剂量( 1×105/0.2 mL/20
g、5×105/ 0.2 mL/20 g、1×106/0.2 mL/20 g)通过尾静脉进行移植，移植 45 d 后，Morris 水迷宫实验
检测其学习记忆能力，苏木精-伊红染色观察大鼠脑海马 CA1 区的病理变化。
结果与结论：①与正常组比较，模型组大鼠学习记忆能力明显降低；与模型组比较，细胞移植中剂量
组水迷宫逃避潜伏期显著缩短(P < 0.05)，穿越平台次数显著增加(P < 0.05)；②模型组脑海马 CA1 区
细胞排列紊乱，核仁不清，部分细胞浓缩深染；移植中剂量组细胞排列整齐，核仁明显，染色质分布
均匀，个别细胞深染；③结果表明，中剂量的脐带间充质干细胞移植能增强老年痴呆大鼠的学习记忆
能力。
关键词：
干细胞；移植；脐带间充质干细胞；老年痴呆；学习记忆能力
主题词：
脐带；间质干细胞移植；阿尔茨海默病；组织工程
脐带间充质干细胞对老年痴呆模型大鼠学习记忆能力的干预
造模：
D-半乳糖诱导老年
痴呆大鼠模型。
干预：
通过尾静脉注射低、中、高 3个剂
量(1×105/0.2 mL/20 g 、5×105/0.2
mL / 20 g 、1×106/0.2 mL/20 g) 脐
带间充质干细胞。
结果：
Morris 水迷宫实验和脑海马 CA1 区
病理形态变化结果显示：中剂量的
脐带间充质干细胞移植对老年痴呆
大鼠的学习记忆能力有改善作用。
Zhou Jun, Master,
Attending physician,
Hainan Provincial Anning
Hospital, Haikou 570100,
Hainan Province, China
Corresponding author:
Zhou De-sheng, M.D.,
Chief physician, Professor,
Department of
Encephalopathy, First
Affiliated Hospital of Hunan
University of Chinese
Medicine, Changsha
410007, Hunan Province,
China
Different doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells improve learning
and memory ability of dementia rats
Zhou Jun1, Zhou De-sheng2 (1Hainan Provincial Anning Hospital, Haikou 570100, Hainan Province,
China; 2Department of Encephalopathy, First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,
Changsha 410007, Hunan Province, China)
Abstract
BACKGROUND: To delay the onset of Alzheimer’s disease, transplantation of viable and well-
differentiated stem cells is expected to repair neural tissue, which has been an issue of concern.
OBJECTIVE: To explore the effects of different doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells
(hUCMSCs) on learning and memory ability of Alzheimer’s disease rats.
METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats, 7 months of age, were randomized into normal, model, high-,
middle- and low-dose hUCMSCs groups (n=10 per group). Rats in model and UCMSCs groups were
used to make Alzheimer’s disease animals through intraperitoneal injection of 150 mg/kg D-galactose for
90 days, and rats in the normal group were given intraperitoneal injection of normal saline for 90 days. In
the three hUCMSCs group, passage 3 hUCMSCs at doses of 1×105/0.2 mL/20 g, 5×105/0.2 mL/20 g, and
1×106/0.2 mL/20 g were injected via the tail vein, respectively. Forty-five days after cell transplantation,
Morris water maze test was used to detect rat’s learning and memory abilities, and hematoxylin-eosin
staining was used to observe pathological changes of the rat hippocampal CA1 region.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal group, the rats in the model group showed
significant reduction in the ability of learning and memory. Compared with the model group, the escape
latency was significantly shortened in the middle-dose hUCMSCs group (P < 0.05), while the number of
passing times through the platform was increased significantly (P < 0.05). In the model group, the cells in
the hippocampal CA1 region were arranged irregularly with unclear nucleoli and a part of cells were
concentrated and deeply stained. In the middle-dose hUCMSCs group, the cells in the hippocampal CA1
region were arranged regularly with clear nucleoli, and only individual cells were stained deeply. These findings indicate that middle-
dose hUCMSCs transplantation can improve the learning and memory abilities of Alzheimer’s rats.
Subject headings: Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Alzheimer Disease; Tissue Engineering
Cite this article: Zhou J, Zhou DS. Different doses of human umbilical cord mesenchymal stem cells improve learning and memory
ability of dementia rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7524-7529.
0 引言 Introduction
随着生活水平的提高，人均寿命随之增加，全球
人口趋于老龄化，老年痴呆症的发病率逐年上升，已
成为威胁人们晚年健康的一大隐患[1-2]。老年性痴呆症
的病理特征主要有老年斑、神经元纤维缠结等，临床
伴有认知能力障碍[3-4]。近年来，治疗老年痴呆的药物
和方法越来越多，研究表明多种药物或者运动等方法[5-
6]，都可以减缓老年痴呆症的发病进程，但效果仍不是
很理想。近来，细胞移植已成为神经再生修复治疗研
究的干预手段。因此，移植有活力、分化能力强的干
细胞修复神经组织来延缓老年痴呆症的发病进程是研
究人员的重要目标。
老年痴呆患者出现最早的症状是外显记忆的障碍，
如联想、学习、回忆和再认等，学习速率明显下降[7-
8]。老年性痴呆的机制可能与脑组织中谷胱甘肽过氧化
物酶、超氧化物歧化酶活性下降，脂质过氧化产物丙
二醛生成有关[9-10]。
人脐带间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，
属于多能干细胞，它具有高度自我更新和多向分化潜
能等特点，成为干细胞领域的研究热点。越来越多的
研究应用干细胞移植方法来探讨其对老年痴呆大鼠的
治疗效果[11-13]。因此，实验拟向老年痴呆大鼠移植脐带
间充质干细胞，观察其能否改善其学习记忆能力，为
人类老年痴呆的治疗提供实验依据。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 于2015年3至12月在湖南中医药大学
第一附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 健康老年SD大鼠50只，7月龄，SPF
级，体质量250-550 g，购于中国医学科学院实验动物
中心，许可证号SCXK(京)2012-0005，饲养于湖南省
实验动物中心，温度为(25±2) ℃，湿度为(50±5)%，
昼夜比例为1∶1。实验过程中对动物处置符合2006年
中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动
物的指导性意见》标准。
1.3.2 脐带来源 脐带标本取自健康足月剖宫产的新生
儿，由湖南中医药大学第一附属医院产科协助完成，
均已征得产妇及家属授权同意和医院伦理委员会批准。
1.3.3 主要试剂 胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶、
青 霉 素 、 链 霉 素 、 谷 氨 酰 胺 (美国GIBCO 公 司 )；
DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；二甲基亚砜(Sigma
公司)；小鼠单克隆抗大鼠CD29、小鼠单克隆抗大鼠
CD44(美国Abcam公司)。
1.3.4 主要仪器 MCV-16BSU超净工作台(德国Sanyo
公 司 )；CytoFLEX 流 式 细 胞 仪(BD 公 司 )；Milli-Q
labconco 纯水 机 (美国Millipore 公 司 )；倒 置 显微 镜
(Leica 公 司 )；CO2恒 温 培 养 箱 (Forma
3110，Thermo)；培养板(美国 Corning公司)；低温高
速离心机(美国Sigma公司)；电热恒温水浴槽(森信DK-
8D，中国)；MORRIS水迷宫(DMS-2型，动物研究所)；
YLS-3TB跳台记录仪(济南益延科技发展有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养 将脐带剪成均
匀小段，每段2 cm，用生理盐水多次冲洗洗去残留的
血块，用Hank’s缓冲液洗3次，眼科剪剪碎，加入2倍
体积的0.15% Ⅰ型胶原酶，37 ℃、振荡消化40 min；
待充分消化后，加入等体积的体积分数为15%血清的
DMEM培养基，1 000 r/min离心6 min，倒去上清液，
再用含体积分数为15%血清的DMEM培养基重悬细胞，
200目钢筛过滤，以合适密度接种于25 cm2培养瓶中，
放入37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，当细胞
生长达80%-90%融合时进行传代培养。
1.4.2 人脐带间充质干细胞的免疫表型检测 取第3代对
数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后，1 000 r/min离心
6 min，弃上清，用PBS重悬，按照每管2×106个细胞
吸至离心管，再次1 000 r/min离心6 min，弃上清，加
入300 μL PBS重悬，分别加入APC标记的小鼠单克隆
抗大鼠一抗CD44，PE标记的小鼠单克隆抗大鼠一抗
CD29，混匀，室温下避光孵育20 min，加入缓冲液，
1 000 r/min离心6 min，弃上清后再次加入PBS重悬，
离心，弃上清，上流式细胞仪检测。
1.4.3 腹腔注射D-半乳糖建立老年痴呆动物模型 选取
50只SD雌性大鼠随机分为正常组、模型组以及低、中、
高剂量人脐带间充质干细胞移植组，每组10只。模型
组、人脐带间充质干细胞移植组腹腔注射D-半乳糖150
mg/kg，1次/d，连续90 d，制备老年痴呆动物模型。
正常组注射等量生理盐水。
1.4.4 人脐带间充质干细胞移植 老年痴呆动物模型建
立后，将第3代人脐带间充质干细胞接种于75 cm2培养
瓶，待细胞长至70%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，调
整细胞所需浓 度 ，以高、中、低(1×106/0.2 mL/20
g、5×105/0.2 mL/20 g、1× 105/0.2 mL/20 g)3个剂量
通过尾静脉进行移植[11]。
1.4.5 Morris 水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力 细胞
移植45 d后进行水迷宫实验。①适应训练：首先练习
站台，放于平台上2 min，然后开始入水训练，每只大
鼠训练2次，从不同象限入水，每次2 min，如果找不到
站台，应引导至站台，停留2 min；②定位航行实验：
时间共历时4 d，将平台置于第4象限中心，于每天上午
固定时间段进行3次测试，每次测试时间1 min，象限池
壁的中点作为入水点，但放置平台的第4象限不作为入
水点，3次测试的入水顺序相同，但每个入水点不重复。
如果大鼠在90 s内未找到平台，则由实验者将其引至平
台，让其在平台上停留90 s，再放回笼内。以大鼠入水
后到找到平台的游泳时间(即逃避潜伏期)做为观测指标，
90 s内未找到平台的记为90 s；③空间探索实验：于定
位航行实验结束后第2天上午撤除平台，然后将大鼠从
相同的象限轻轻放入水中，记录大鼠在90 s内的平均游
泳速度、在第4象限停留的时间和路程、穿越平台位置
次数。
1.4.6 苏木精-伊红染色观察海马组织CA1区细胞形态
水迷宫实验结束后，每组随机选取6只大鼠，腹腔注射
水合氯醛麻醉，断头处死，取海马组织CA1区，用体
积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚5 μm，
摘要：
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周俊（1983年生湖南永州人2010年湖南中医药大学硕士毕业主治医师）与周德生博士（湖南中医药大学第一附属医院脑病科教授）研究了移植不同剂量脐带间充质干细胞（hUCMSCs）对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响。研究选取50只7月龄SD大鼠随机分为正常组、模型组及高、中、低剂量hUCMSCs移植组每组10只。模型组和移植组通过腹腔注射D半乳糖建立老年痴呆模型正常组注射生理盐水。收集第3代hUCMSCs以不同剂量通过尾静脉移植。45天后通过Morris水迷宫实验检测学习记忆能力苏木精伊红染色观察海马CA1区病理变化。结果显示与模型组相比中剂量hUCMSCs移植组水迷宫逃避潜伏期显著缩短穿越平台次数显著增加且海马CA1区细胞排列整齐核仁明显。这表明中剂量hUCMSCs移植能增强老年痴呆大鼠的学习记忆能力。
